钠背景电流前沿信息_钠背景电流是谁形成的(2024年12月实时热点)
WB实验常见问题及解决方法,避开这些坑! Western blot(WB)实验虽然基础,但总是让人头疼。即使是老手,也难免遇到各种问题。下面我根据经验总结了一些WB实验中常见的异常问题及解决方法,希望对正在做WB实验的小伙伴们有所帮助。 无条带 蛋白表达量低:首先,要充分了解你研究的蛋白,如果表达量低,可以适当增加上样量,一般在20-50之间。 非特异性条带:有时候条带不明显是因为本底表达或诱导表达,非特异性条带导致的。 蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂:在提取蛋白时,一定要使用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,并设置对照,避免蛋白降解。 一抗特异性:检查一抗的特异性是否适合你的目的蛋白,最好买经过验证的一抗和二抗。 转膜效率低:可以用丽春红染色检查转膜效率,特别是分子量小的蛋白,用小孔径的膜。 调整转膜时间和电流:适当调整转膜的时间和电流,优化转膜效果。 超敏发光液:如果分子量表达低,可以选择超敏的发光液。 有阳性条带,但条带比较弱 抗体染色不充分:增加抗体浓度,延长孵育时间。 酶活性降低:将酶和底物直接混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内的酶联物。 标本中靶蛋白含量太低:增加标本上样量。 洗膜过度:缩短洗涤时间。 HRP 抑制剂:所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。 抗体活性降低:选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置。 封闭过度:减少封闭剂的量或缩短时间,换用不同封闭剂类型。 曝光时间过短:延长曝光时间。 背景高 上样量多:适当减少上样量。 洗膜不充分:增加洗液体积和洗涤次数,原则可以快洗慢孵育。 阻断不充分:选择合适的封闭试剂,增加封闭液孵育时间,封闭浓度。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。脱脂奶粉含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用BSA代替奶粉作为封闭剂。 抗体过多:降低抗体浓度,使用单抗,减少二抗孵育时间。 检测过程中膜干燥:保证充分的反应液,避免出现干膜现象。 曝光过度:缩短曝光时间。 蛋白降解:使用新鲜样本,加入蛋白酶抑制剂,在冰上操作。 膜的选择:用低背景的NC膜替换高背景的PVDF膜。 蛋白剪切形式:查阅数据库文献,了解蛋白的特异性一抗。 希望这些经验能帮助你顺利完成WB实验,避免踩坑!ꀀ
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