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wb去除背景权威发布_wb 背景脏(2024年12月精准访谈)

内容来源：德赛环球网所属栏目：观点更新日期：2024-11-30

wb去除背景

半定量WB数据处理指南：简单9步搞定！每次用Image J处理数据都忘记操作步骤？别担心，跟着这个简单指南，轻松搞定半定量WB数据！𐟑‡ 打开文件：点击File菜单，选择你要处理的图片，或者直接拖入图片文件。转换图像类型：选择Image→Type→8-bit。设置测量参数：点击Analyze→Set Measurements。设置比例尺：选择Analyze→Set Scale。去除背景：使用Process→Subtract Background功能，降低背景干扰。反转图像：点击Edit→Invert。框选区域：使用框选工具框选你感兴趣的区域，然后点击Analyze→Measure。重复操作：重复上述步骤，得到你需要的数据。计算归一化值：首先将各个样品的Met值除以Tubulin，然后进行归一化处理。按照这个步骤操作，你就能轻松处理半定量WB数据啦！𐟎‰

WB实验背景脏？6个步骤教你解决！在进行WB（Western Blot）实验时，背景脏是一个常见的问题。𐟘“ 明明跑出了想要的趋势，但背景却一团糟，这该如何解决呢？其实，背景脏并不一定是因为仪器不干净，也可能是蛋白降解或者实验条件不合适导致的。以下是一些可能出错的关键步骤，以及如何避免这些问题的建议：实验准备首先，确保所有用于提取蛋白的研磨器材、制胶的玻璃板和梳子都清洗干净。如果这些器材长时间不使用，建议在使用前再次清洗，以杜绝污染。提取蛋白选择合适的蛋白裂解液，这样可以去除一些干扰因素，如核酸、多糖和脂类等。蛋白在测量浓度后应变性分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。此外，确保Loading buffer在保质期内，并在加入蛋白后充分混匀，再煮沸变性。制胶在制胶过程中，玻璃板夹紧后，有些人习惯性加水测试是否漏胶。建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水。灌胶前要将配好的试剂充分混匀，灌胶时要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡。灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，速度一定要慢，防止胶面被冲变形。温度较高时，30分钟左右就会凝固；冬天气温较低可能需要较长时间。若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。转膜转膜前需在转膜板两侧各放置3至4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空。转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用220V或者其他高电压进行。机器温度升高会使蛋白降解，导致转膜后条带跑糊，发光后条带和背景也会脏得一塌糊涂。孵育抗体孵育一抗的时间大多选择4℃过夜，也可以室温封闭2小时。4℃过夜效果会比室温好。二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1到2小时。抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。发光液配置大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1:1的比例配置。发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量。发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。通过以上步骤，可以有效解决WB实验背景脏的问题，让你的实验结果更加清晰准确！𐟒ꀀ

WB实验迷茫？看这篇就够！ 1⃣️ 如何避免胶跑得不漂亮？配胶：清洗玻璃板并检查是否漏气，避免胶凝固不均匀。倒胶时要充分混合并去除气泡。双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀释分离胶。平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10分钟，待胶与电泳液温度一致再进行电泳。上样：拔出上样梳时要保持水平，避免上样孔倾斜。在样品两侧增加等体积的空白1x loading buffer孔，避免两侧样品条带扩宽。电泳：小电压能使胶的分子筛效应更好。电压越小，条带越漂亮。浓缩胶55V，分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。 2⃣️ 电泳中常见现象： “︶” 条带呈笑脸状 “︵” 条带呈皱眉状条带拖尾纹理（纵向条纹）条带偏斜条带两边扩散 3⃣️ 如何降低WB背景？膜封闭不够：建议延长封闭时间，选择合适的封闭液。一抗稀释度不适宜：太高时选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育温度偏高：建议4℃过夜孵育。膜选择不当：NC膜的背景通常比PVDF膜低，但吸附力稍差。膜干燥或反复接触：实验过程中要保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。曝光时间过长：可减少曝光时间。 4⃣️ 如何减少杂带？目的蛋白存在多个修饰位点。目的蛋白有其他剪切本。样本处理过程中目的蛋白发生降解（最常见）。上样量过高：适当减少上样量。 5⃣️ 如何解决无信号或信号弱的问题？目标蛋白未提取出来：选用合适的裂解液。目标蛋白表达低：增加上样量。转移不完全或过转移：适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。一抗孵育时间不足：建议4℃结合过夜。二抗与一抗不匹配：选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度：缩短洗膜时间。 6⃣️ 其它现象：膜上多处出现黑点或黑斑：抗体与封闭试剂发生非特异性结合，或奶粉未充分溶解粘在膜上。反白（条带显白色）：目的蛋白含量太高或一抗浓度偏高。蛋白分子量偏低或偏高：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

华为手机摄影技巧：旅行大片拍摄指南 𐟓𘊩똨€ƒ结束后，同学们是不是都迫不及待地想要去旅行了？想要拍出单反级的大片，华为手机绝对是你的好帮手！下面我来教大家几个简单的拍照技巧，赶紧拿上你的华为手机试试吧！ 1️⃣ 拍星光𐟌Ÿ 想要捕捉星光的美丽，可以试试这个设置：相机模式：专业模式 ISO：800 快门速度：1/25秒对焦：自动对焦（AF）白平衡：自动（WB）光圈：F2 主摄拍摄 2️⃣ 拍月亮𐟌™ 想要突出月亮的美丽，可以试试这个设置：相机模式：专业模式 ISO：50 快门速度：1/400秒对焦：手动对焦（MF）白平衡：自由调整放大画面，突出月亮主体 3️⃣ 拍烟花𐟎† 想要捕捉烟花的绚烂，可以试试这个设置：相机模式：专业模式 ISO：50 快门速度：0.5~1秒对焦：自动对焦（AF）白平衡：5400K 适当放大画面，提升观感 4️⃣ 拍云朵☁️ 想要捕捉云朵的轻盈，可以试试这个设置：相机模式：专业模式 ISO：50 快门速度：1/500秒对焦：手动对焦（MF）白平衡：暖色5600K，冷色4600K 放大画面，去除杂乱背景学会了吗？赶紧拿出你的华为手机，试试这些技巧吧！拍出美美的旅行大片，分享给我们看看~ 𐟓𘀀

WB操作指南：减少99%弯路的实用技巧 ### 转膜注意事项 𐟓Œ 大分子量蛋白：在转膜缓冲液中加入0.1%的SDS。将甲醇浓度降至10%或更低，使用4℃湿转过夜代替半干法转膜。增加转膜时间和电流/电压。小分子量蛋白：去除缓冲液中的SDS。保持甲醇浓度在20%。使用小孔径的膜。降低转膜时间和电流/电压。膜的方向确定 𐟧튨𝬧绥Ž剪角做标记，分清正反面。用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的。转膜后背景高 𐟌미 选择NC膜。转膜时污染 𐟚늩🥅手指触碰膜，可以用镊子取膜。油脂和蛋白质会弄脏膜。滤纸的大小 𐟓 确保滤纸和膜的大小与胶一致。使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。膜封闭 𐟔’ 封闭目的：转印结束后，必须将对印迹膜上未被占据的蛋白结合位点封闭掉以防止非特异性探针结合。如果没能将膜上位点全部封闭，会导致印迹膜出现较高的背景。脱脂奶粉：通常使用浓度为2.5%~5%。不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。牛血清蛋白（BSA）：通常使用浓度为2%~5%。某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号。抗体孵育 𐟧슦Š—体孵育原理：一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。抗体选择：根据官网了解该抗体发表文献的数量，选择发表文献较多的货号。根据实验动物的种属性选择合适的抗体，比如小鼠的一抗需要选择抗小鼠的。根据实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择能够满足多种类型实验的抗体。抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。抗体孵育、洗涤注意事项 𐟧𜊤𘀦Š—孵育、洗涤：将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4Ⰳ过夜。一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤。

WB实验全攻略：从零开始到成功曝光在WB实验领域摸爬滚打了四年，我积累了不少心得。从细胞培养的第一步到最后的化学发光成像，每一个细节都至关重要。两天的辛勤工作，往往在曝光的瞬间决定成败。下面是我总结的一些关键步骤，希望能帮到你们。电转：关键的一步 𐟔犦🀦𔻐VDF膜：PVDF膜需要在甲醇和4度中激活30分钟。电泳后处理：电泳结束后，取出胶板，短玻璃板朝上放置。揭开短玻璃板后切除多余的胶，在水中将胶从长玻璃板上取下。转膜：在电转液中，转膜夹黑色面朝下，依次放置石棉网-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-石棉网，夹紧转膜夹，注意PVDF膜要与胶贴合，排走气泡。调整转膜夹黑色界面转向转膜槽负极，白色面朝向转膜槽正极。灌满电转液后，用200mA恒定电流转膜120分钟（具体条件自行探索），转膜槽外周装满冰块。封闭：去除背景的关键 𐟐„ 转移膜：将膜取出后，应观察到marker完全从胶转移至膜上。清洗：用TBST快速清洗掉膜上残留的电转液。封闭：将PVDF膜浸泡在5%封闭牛奶中，缓慢摇荡，室温孵育1小时。抗体孵育和化学发光成像：让蛋白可视化 𐟌Ÿ 一抗孵育：封闭结束后，用1㗔BST缓冲液洗掉多余的牛奶，洗膜每次5分钟，共3次。一抗使用一抗稀释液或TBST按照1：5000稀释（具体条件自行摸索），然后将膜浸泡在一抗中，于4℃冰箱中摇床孵育过夜。二抗孵育：一抗孵育后并回收，加入1㗔BST缓冲液放置于摇床上快摇5分钟，共3次。使用5%脱脂牛奶按照1:1000稀释二抗，室温慢摇1小时。化学发光成像：二抗孵育完毕后，回收二抗，1㗔BST快洗5分钟，共3次。洗膜结束后，将发光液敷在膜上，通过化学发光成像仪曝光，采集并使用ImageJ分析灰度。希望这些步骤能帮到你们，祝大家实验顺利！𐟒ꀀ

「陈都灵超话」「陈都灵1018生日快乐」本次超话头像及版头一号最后胜出，感谢大家的参与[送花花][送花花][送花花](刚刚接到wb运营通知才得知背景图不能有中文，可以有简单英文，已联系稿主修改)

𐟔젨磦žWB实验中的非特异性条带现象 𐟌ˆ 𐟓Š 案例一：无信号的尴尬可能原因：抗体加错、转膜问题等。解决方案：仔细检查抗体，确认转膜无误。经验：若X光片完全无显色，抗体加错可能性大。若有细微条带，可能是蛋白上样量不足或一抗浓度过低。 𐟓Š 案例二：高背景的困扰可能原因：封闭不充分、一抗浓度过高、洗膜时间不足。解决方案：降低一抗浓度，增加洗膜时间。经验：高背景常见于WB中，目的条带清晰但背景弥漫。注意操作规范，洗膜时间不少于5min*5次或10min*3次。 𐟓Š 案例三：非特异性条带的挑战可能原因：一抗非特异性结合。解决方案：更换一抗。经验：非特异性条带多因一抗质量不佳。可利用阴性对照和阳性对照确定目的条带。 𐟓Š 案例四：边缘规则的白圈可能原因：电转中膜与胶之间存在气泡。解决方案：转膜前去除气泡。经验：电转液倒入盘内，高度与滤纸齐平。检查滤纸与胶之间有无气泡，用U型膜接触胶中间，慢慢放下膜。 𐟓Š 案例五：条带中间出现白色（反白）可能原因：中心部位底物消耗过快。解决方案：降低蛋白量，降低一抗和二抗浓度。经验：在底物消耗前定影X光片，或从降低蛋白量和抗体浓度入手。

𐟓𑥰米手机拍照参数大揭秘！ 𐟓𘠥𐏧𑳦‰‹机拍照功能强大，掌握这些参数，轻松拍出专业大片！ 𐟌… 拍日落：进入专业模式，ISO设为80，快门S为1/1600，对焦MF，WB设为5400。根据画面适当放大，捕捉夕阳的美丽瞬间！ 𐟌• 拍月亮：专业模式，ISO80，快门S1/400，对焦MF，WB根据个人喜好调整。让月亮在夜空中更加璀璨！ 𐟎† 拍烟花：专业模式，ISO64，快门S0.5~1，对焦AF，WB5200。根据画面美观度适当放大构图，让烟花绽放更绚烂！ 𐟌𓠦‹风景：专业模式，ISO100，快门S1/160，对焦AUTO，WB5400。根据画面美观度放大去除杂乱前景，展现大自然的壮丽景色！ 𐟌ƒ 城市夜景：专业模式，ISO50，快门S1/10，对焦AUTO，WB4600。调整构图后主摄开拍，捕捉都市的繁华与美丽！ 𐟑堦‹人文：专业模式，ISO100，快门S1/10，对焦AUTO，WB5200。选择3.2倍的75mm长焦镜头，捕捉人文的细腻与情感！ 𐟌Œ 拍星空：准备三角架或固定手机，定时拍摄+2S。快门S6400，曝光时间15~30秒，对焦AU，WB4800。去空旷地拍摄，去除杂乱前景后主摄开拍！ 𐟒 拍鲜花：专业模式，ISO250，快门S1/400，对焦AUTO，WB5200。根据画面美观度放大去除杂乱背景，展现花朵的娇艳与纯洁！ 𐟍𝯸 拍美食：专业模式，ISO200，快门S1/100，对焦AU，WB5500。放大去除杂乱背景后主摄开拍，让美食更加诱人！

丽春红染色：抗体浪费的终结者在实验室中，抗体通常价格昂贵，而且转膜过程是否成功也难以确定。这时候，丽春红染色就派上用场了！它不仅能确认蛋白转膜的成功，还能评估蛋白的表达水平，甚至可以作为定量分析的基础。以下是详细的实验步骤： 𐟓 实验步骤：转膜完成后，取出膜（可洗可不洗），将转印好的膜放入盛有丽春红染液的容器中，室温下摇床孵育10分钟左右（具体时间根据使用的染液说明进行，也可以边染边观察，蛋白区出现红色的条带即可）。取出转印膜，用纯水冲洗膜，使背景干净，观察并拍照记录结果。观察结束后，继续用纯水冲洗，然后再用TBST洗几遍，直到差不多看不到红色的背景或丽春红完全去除，然后进行封闭，孵抗体等后续WB步骤。 ⚠️ 注意事项：丽春红染色一般在封闭前进行，染出来的效果更好。此外，在染色过程中加入辅助剂可提高染色效果。封闭之后再进行染色，封闭层会阻碍染料渗透，影响染色效果。丽春红可用于PVDF膜、硝酸纤维膜和醋酸纤维素膜上的蛋白检测，但不适用于尼龙膜上的蛋白检测。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用水或其他洗涤缓冲液洗去，不会影响后续用于检测抗原的显色反应。通过这些简单的步骤和注意事项，你可以轻松确认转膜是否成功，评估蛋白表达水平，并进行定量分析。再也不用担心浪费昂贵的抗体了！

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