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一抗背景脏前沿信息_一抗背景脏的图片(2024年12月实时热点)

内容来源：德赛环球网所属栏目：教程更新日期：2024-12-02

一抗背景脏

WB实验注意事项：战胜西方印记的秘诀！ 𐟓Š 电泳注意事项制胶要均匀：胶越均匀，条带越窄，分离效果越好。压平下层胶：加入下层胶后，用无水乙醇或水压平，避免形成波浪状。上层胶要多配：防止漏液。梳子要垂直：拔出时要小心，可用针头拨正。电泳液回收：次数不宜太多，以免影响电流。电泳液浑浊：及时弃掉，否则影响电泳。上样速度：要快，尽快电泳，冰浴条件下进行。 𐟔„ 电转注意事项戴手套：全程使用手套和镊子，避免直接触碰膜。激活PVDF膜：提前泡在甲醇中激活，再放入转膜液中中和。标记PVDF膜：提前做好标记，方便区分。选择合适膜：大蛋白用0.45um，小蛋白用0.22um。裁膜：注意胶的大小，过大过小都会影响转膜。滤纸：薄滤纸两侧各用两张，厚滤纸两侧各垫一张。气泡：转膜时不能出现气泡，要及时排出。冰浴：转膜时释放大量热量，冰浴至关重要。 𐟔’ 封闭注意事项封闭液比例：注意配置比例，切勿配错。摇匀封闭液：摇匀封闭液，避免背景脏。封闭液使用次数：封闭液出现颗粒感时就不能用了。 𐟐𐠥�𘀦Š—二抗注意事项稀释比例：注意一二抗的稀释比例，仔细阅读说明书。选择一抗：根据样本选择一抗，根据一抗种属选择二抗。有效期：在有效期内使用一二抗。孵育条件：一抗建议4℃冰箱中摇床孵育过夜，防止背景高。通过这些注意事项，你可以更好地掌握WB实验的技巧，提高实验结果的准确性。

𐟓𘠗B实验避坑指南：封闭孵育与显影技巧 1. 𐟥› 封闭技巧：封闭的目的是用牛奶中的非抗原蛋白覆盖膜上的抗体，减少背景干扰，使条带更清晰。封闭时间应足够长，通常至少一个半小时。如果时间紧迫，可以使用快速封闭液，但效果可能稍差。 𐟥› 封闭液选择：脱脂牛奶用于磷酸化蛋白的封闭是可行的，但食品级奶粉不行，实验级奶粉可以尝试。BSA的封闭效果不如牛奶，背景较脏。 𐟧ꠤ𘀦Š—使用注意事项： 𐟔 抗体稀释浓度：根据说明书范围调整，背景过深时降低浓度，条带信号弱时增加浓度。 𐟏ž️ 抗体适用范围：确保抗体适用于WB，并与人源或鼠源样本匹配。 𐟐𐠦Š—体宿主：选择匹配的二抗，一抗通常是兔抗或鼠抗。 𐟓… 特殊说明：注意抗体是否有特殊孵育时间和曝光时长要求。 𐟧ꠤ𘀦Š—孵育：使用孵育盒，每个孔至少加3.5ml抗体。第一次配4ml，每次使用后回收抗体，补加TBST和抗体原液。回收后的抗体在4度保存一周失效，-20度可保存一个月。 𐟐 二抗选择：通常选择羊抗，与一抗匹配。经费紧张时，二抗可回收使用3-4次。 𐟓𘠦˜𞥽𑦊€巧：显影液要均匀滴在条带上，正反两面都要滴。显影液会失效，自动曝光时间较长时需更换新液。显影时将蛋白面朝上，如果显影不好，可以尝试翻面显影。 ⚠️ 不推荐的方法：不均匀滴显影液可能会影响结果。通过这些技巧，可以有效提高WB实验的准确性和可靠性。

WB实验常见问题及解决方法详解大家好，今天我们来聊聊WB实验中一抗孵育的注意事项和一些常见问题。希望这些小贴士能帮助大家在实验中少走弯路，早日取得满意的结果！内参选择的小窍门 𐟧 在WB实验中，内参的选择非常重要。内参通常用于对照目的蛋白的相对丰度。选择内参时要考虑目的蛋白的分子量（一般建议目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上，但不要差距太大），表达部位以及实验的具体情况。具体注意事项可以参考图一。抗体回收？不推荐！ 𐟚늊关于抗体的回收和重复使用，我们并不推荐。使用过的抗体可能会因为浓度变化和污染问题而影响实验结果。所以，还是一次性使用为好。常见问题解析 𐟔 没有条带可能原因：抗体变质或种属选择错误。确认抗体是否超过保质期或保存得当。确认说明书上是否有推荐所用的物种。背景脏或非特异性条带可能原因：一抗特异性不好或浓度过高。由于大多数抗体的开发基于多肽免疫，容易出现非特异性结合。增加漂洗次数与时间。优化曝光时间。优先选择特异性好的抗体，如兔单抗。适当提高一抗稀释比并4Ⰳ过夜孵育。抗体稀释液中增加脱脂奶粉。条带信号弱可能原因：一抗浓度低。适当提高一抗浓度。增加一抗孵育时间。更换效价更高的一抗。降低洗涤液中的去污剂浓度和漂洗时间/次数。条带反白可能原因：一抗浓度过高。有的小伙伴发现条带信号较弱后就开始提高一抗浓度并增加上样量，结果中心部位高浓度HRP底物很快被消耗殆尽，然后就不发光了，于是出现反白条带。调整建议：降低一抗浓度。小结 𐟓 今天的“战神”专辑就暂时到这了，希望这些小贴士能帮助大家在WB实验中少走弯路，早日取得满意的结果！下次再见！

𐟔젗B实验常见问题解答集锦一. 𐟏… 电泳常见问题电泳条带扭曲：可能是电泳槽内部电泳液未加满或漏液，及时加满电泳液可使条带变直。电泳条带拖尾：样本溶解不均匀可能导致拖尾，确保样本溶解后再上样。电泳条带扩散：加样量过多会导致条带扩散，适当减少上样量可改善。溴酚蓝呈笑脸状：泳道底部中间高、两边低，可能是制胶试剂温度高或制胶后未及时保湿，导致胶不均匀冷切。可降低电压，缓慢电泳，或在冰浴条件下进行。二. 𐟔„ 电转常见问题膜转反：注意“黑胶红膜”原则，即转膜夹黑色部分对应胶，红色部分对应膜。转膜夹放置错误：确保转膜夹红色对红色，黑色对黑色。背景有气泡：转膜过程中气泡会导致不均匀的白色斑点，转膜时要仔细检查，避免气泡产生。三. 𐟔’ 封闭常见问题背景脏：封闭不充分可能导致背景脏，可延长封闭时间或更换封闭液。条带有黑色斑点：封闭液未完全溶解会导致黑色斑点，封闭液需充分摇匀。条带信号弱：过度封闭可能使信号弱，可适当降低封闭液浓度或更换封闭液。封闭时间过长：封闭时间过长可能影响抗原抗体结合，建议封闭时间为常温1-2小时，并减少封闭液中的蛋白浓度。膜上有黑点和黑斑：可能是膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合，封闭液需完全溶解并混匀，选择纯牛奶作为封闭液，封闭后彻底清洗。非均一性背景：膜可能过干导致非均一性背景，操作过程中注意保持膜湿润。非特异性条带：封闭不彻底可能导致非特异性条带，重新调整封闭条件，选择适合的封闭液，适当提高封闭物浓度，延长封闭时间。抗体与封闭试剂反应：使用前过滤封闭试剂可避免此问题。四. 𐟐 孵一抗二抗常见问题蛋白条带信号弱：抗体孵育不完全可能导致信号弱，增加抗体浓度和延长孵育时间可改善。背景有白色斑点：抗体孵育不均匀可能导致不均匀的白色斑点，孵育抗体时使用摇床可避免此问题。

WB实验详解，一文搞定！ Western blot（WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（跑胶）将不同大小的蛋白质分离，然后转移到固相载体（膜）上，再通过特异性抗体与目标蛋白质反应，最后通过标记的二抗进行酶促反应或反射自显影检测特定的蛋白质条带。以下是WB实验的详细流程和基本原理。 ✅实验流程样品制备：使用SDS和𗯥Ÿ𚤹™醇处理样品，使蛋白质变性和解聚成单链状态。电泳分离：在PAGE中，蛋白质根据其大小和电荷被分离成不同的条带。转膜：在电流作用下，凝胶中的蛋白质被转移到固相载体（PVDF膜或NC膜）上。封闭：使用牛奶或牛血清蛋白等高蛋白封闭剂孵育，减少抗体的非特异性结合，降低背景。一抗：一抗与蛋白质形成抗原抗体复合物。二抗：二抗与一抗结合。显影：通过底物显色或放射自显影检测信号，从而看出目的蛋白质的相对表达量。 ✅基本原理将不同大小的蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（跑胶）分离后，转移到固相载体（膜）上。在通过特异性抗体与目标蛋白质反应（一抗），最后通过标记的二抗进行酶促反应或反射自显影检测特定的蛋白质条带（二抗+显影）。 ✅学会看图首先看内参（如tubulin、actin、gapdh等），一般需要控制内参是一致的，即灰度值相近。再看目的蛋白质的表达量，图的最上面一般会标明每个泳道的蛋白质样是如何处理的，通过不同泳道的灰度值能看出与control相比的目的蛋白质的相对表达量。通过这些步骤，你可以更好地理解和掌握Western blot实验的原理和流程，从而更好地进行实验设计和数据分析。

WB实验背景脏？6个步骤教你解决！在进行WB（Western Blot）实验时，背景脏是一个常见的问题。𐟘“ 明明跑出了想要的趋势，但背景却一团糟，这该如何解决呢？其实，背景脏并不一定是因为仪器不干净，也可能是蛋白降解或者实验条件不合适导致的。以下是一些可能出错的关键步骤，以及如何避免这些问题的建议：实验准备首先，确保所有用于提取蛋白的研磨器材、制胶的玻璃板和梳子都清洗干净。如果这些器材长时间不使用，建议在使用前再次清洗，以杜绝污染。提取蛋白选择合适的蛋白裂解液，这样可以去除一些干扰因素，如核酸、多糖和脂类等。蛋白在测量浓度后应变性分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。此外，确保Loading buffer在保质期内，并在加入蛋白后充分混匀，再煮沸变性。制胶在制胶过程中，玻璃板夹紧后，有些人习惯性加水测试是否漏胶。建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水。灌胶前要将配好的试剂充分混匀，灌胶时要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡。灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，速度一定要慢，防止胶面被冲变形。温度较高时，30分钟左右就会凝固；冬天气温较低可能需要较长时间。若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。转膜转膜前需在转膜板两侧各放置3至4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空。转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用220V或者其他高电压进行。机器温度升高会使蛋白降解，导致转膜后条带跑糊，发光后条带和背景也会脏得一塌糊涂。孵育抗体孵育一抗的时间大多选择4℃过夜，也可以室温封闭2小时。4℃过夜效果会比室温好。二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1到2小时。抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。发光液配置大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1:1的比例配置。发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量。发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。通过以上步骤，可以有效解决WB实验背景脏的问题，让你的实验结果更加清晰准确！𐟒ꀀ

玄学WB实验的那些坑，你踩过吗？𐟘… 做WB实验的小伙伴们，你们是不是也遇到过一些让人头疼的问题？今天就来聊聊那些玄学WB实验中需要注意的事项，希望能帮到你们！背景脏乱差 𐟘– 有时候你会发现背景脏得不行，甚至有不规则的成片。这可能是因为封闭不充分。解决办法其实很简单：要么延长封闭时间，要么换换封闭液。相信我，这招绝对有效！条带上有黑色斑点 𐟤” 如果你发现条带上出现了黑色斑点，那很可能是封闭液没完全溶解。记得每次用封闭液之前都要充分摇匀哦！不然的话，实验结果可是会大打折扣的。条带信号太弱 𐟒” 有时候条带信号太弱，可能是因为过度封闭。这时候你可以试试降低封闭液的浓度，或者干脆换一种封闭液。毕竟，适度才是王道嘛！封闭时间太长 ⏳ 封闭时间太长也会影响抗原抗体的结合。一般来说，封闭时间在常温下1-2小时就够了。而且，封闭液中的蛋白浓度也要控制好，别太高也别太低。膜上出现黑点和黑斑 𐟖䊥悦žœ你发现膜上有黑点和黑斑，那很可能是膜上其他部位与一抗或者二抗发生了非特异性结合。这时候，封闭液一定要完全溶解并混匀，封闭牛奶也要选纯的。封闭结束后，记得好好洗干净哦！希望这些小贴士能帮到你们，让你们的WB实验更加顺利！如果还有什么问题，欢迎留言讨论哦！𐟒쀀

abmart抗体，实验神器！最近用了abmart的MAPK通路抗体，真心觉得不错，比CST的还要好用呢！分享几款我常用的抗体：经典一抗 - ERK1/2 Antibody（货号T40071）这个抗体特别好用，信号特别强，做实验的时候省了不少心。经典一抗 - Phospho-Erk1(T202/Y204)+Erk2(T185/Y187) Antibody（货号T40072）这个抗体能同时检测Erk1和Erk2的磷酸化，效率超高。经典一抗 - p38 MAPK Antibody（货号T55600） p38的抗体，信号清晰，背景干净，推荐！经典一抗 - JNK1/2/3 Antibody（货号T40073） JNK的抗体，特异性好，适合各种实验需求。经典一抗 - p-JNK1/2/3 (Thr183+Tyr185) pAb（货号T40074）这个磷酸化特异性的JNK抗体，效果非常棒，强烈推荐！经典一抗 - Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Antibody（货号T90391） p38磷酸化特异性的抗体，信号非常清晰，背景干净。总的来说，abmart的这些抗体真的让我省了不少心，实验结果也很满意。如果你也在找好的MAPK通路抗体，不妨试试这些吧！𐟒ꀀ

WB实验全攻略：12个关键步骤详解 1. 𐟧𜠥ꌥ‡†备：确保所有用于提取蛋白的耗材和实验所需物品都已清洗干净。电泳玻璃板应放在置物架上隔开，以避免长期放置后黏连。 𐟒砦Š𝦏蛋白：在整个过程中，抽提蛋白的操作应在冰上进行。裂解液加入后，细胞会被破坏，细胞内的酶会被释放。不在冰上操作会导致蛋白降解。一旦开始抽提，应一次性操作至加入loading Buffer煮蛋白变性。变性后的蛋白不易降解，可以长期保存于-80℃。 𐟧꠩…胶：确保所有配胶所需的试剂都在有效期内。配制分离胶和浓缩胶时，需快速颠倒混合均匀。分离胶需要用去离子水压一下，以去除气泡和压平液面。分离胶凝固后再配浓缩胶，插入孔梳时要快，浓缩胶的凝固时间比分离胶短。为了避免浓缩胶插梳子时有气泡，可以先将浓缩胶倒满，斜着插入，记得梳子的正反一定要放对，否则玻璃板会碎。 𐟔堧…𗯼š蛋白加上loading Buffer后一定要充分混匀，再去煮使蛋白变性。 𐟓 上样：为了美观，需要定量上样。根据BSA与BCA试剂AB现配现用，静置5分钟后检测，计算出每个样本的浓度，定量上样量计算每孔上样量。 ⚡ 电泳：浓缩胶80v30分钟，分离胶120v55分钟（分离胶的时间根据样本跑到图中这条线停止）。 𐟓‘ 转膜：不要直接用手接触膜与滤纸，手上油脂会对其造成污染。佩戴干净手套全程尽量用镊子夹取，避免每一层之间的气泡，让胶与膜之间美美贴合。三层我用的是滤纸，如果有气泡产生一定要拿平的板赶一下气泡。 ❄️ 温度：转膜液现配现用，等需转膜用时再从4℃冰箱中拿出用。一般会在盒子里放上2冰袋，盖上盒子之后再用冰袋和冰块覆盖严实。 𐟕’ 浸泡：封闭液需要充分溶解，不充分溶解会导致曝光时背景脏或一片漆黑。浸泡时间要足够，我一般用震荡机溶解配好的封闭液，浸泡1小时（根据抗体情况可适当延长封闭时间）。膜先在甲醇中浸泡30秒，再在转膜液中浸泡一分钟。 𐟦 抗体孵育：一抗和二抗购买哪家的抗体可在官网找到稀释比例，一般范围值内的我选用最大的稀释倍数。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育时间90分钟。 𐟚🠦𔗨†œ：洗膜一定要洗干净，一抗洗3次，每次10分钟；二抗洗4次，每次10分钟。 𐟓𘠦›光：发光液现配现用，时间过长会引起发光效果不好，背景脏或一片漆黑。发光液及拍摄都需避光。

WB实验封闭技巧：如何选择合适的封闭液？在上一篇文章中，我们讨论了如何在WB实验中进行湿转，今天我们来聊聊封闭这一关键步骤。封闭的目的是为了防止一抗的非特异性结合，从而避免产生非特异条带或背景杂乱。封闭液的选择 𐟧ꊊ选择正确的封闭液可以促进抗原抗体更好地结合。你可以通过抗体说明书来确定是否有特殊的封闭方法，或者根据实验结果进行调整。以下是两种常见的封闭液及其优缺点：脱脂奶粉 𐟥› 脱脂奶粉含有多种蛋白，封闭效果全面。它是最常用的封闭液之一（浓度2.5-5% w/v），经济实惠。然而，由于含有少量残留的生物素和碱性磷酸酶（AP），它不适用于生物素标记和AP标记的抗体系统。此外，脱脂奶粉中含有酪蛋白，这是一种磷酸化蛋白，会导致抗体的非特异性结合，使条带背景变脏，因此不适合用于磷酸化蛋白的检测。牛血清白蛋白 (BSA) 𐟐‚ 对于磷酸化蛋白的检测，推荐使用BSA（浓度2-5 % w/v）。与脱脂奶粉相比，BSA更适用于磷酸化蛋白的检测。需要注意的是，普通级别的BSA可能含有IgG或其他血清蛋白，这些蛋白会与哺乳动物抗体（如抗牛、山羊、绵羊、马等二抗）产生交叉反应，增加非特异性背景信号。因此，建议使用不含IgG的BSA产品。相对于脱脂奶粉，BSA不含生物素，对于生物素标记的抗体系统而言，可能是最好的选择。通过选择合适的封闭液，你可以有效避免非特异性结合，从而提高WB实验的准确性和可靠性。希望这些信息对你有所帮助！

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